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常見的轉(zhuǎn)染方法有哪些種? 什么是細胞轉(zhuǎn)染?

更新時間:2023-11-27   點擊次數(shù):2601次


說到轉(zhuǎn)染法,小伙伴們應(yīng)該比較熟悉脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,那么細胞轉(zhuǎn)染你了解多少呢?本期AVT小編給大家分享一下這個方面的一些知識,感興趣的來看一下吧!

 細胞轉(zhuǎn)染對初接觸細胞實驗的科研人員而言,是一道難過的坎兒,細胞轉(zhuǎn)染率低的話,你珍貴的細胞可能就只能扔掉了。

 大家都知道,細胞是由帶負電荷的磷脂雙分子層構(gòu)成,這對大分子物質(zhì)來說是個不可透過的屏障,比如DNA和RNA的磷酸骨架,為了使核酸穿過細胞膜,開發(fā)了多種技術(shù),大致可分為物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)。

 幾種常見的轉(zhuǎn)染方法:

 1、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法

陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷,能與核酸的磷酸根通過靜電作用,將DNA分子包裹入內(nèi),形成DNA脂復(fù)合物,也能被表面帶負電的細胞膜吸附,再通過融合或細胞內(nèi)吞進入細胞。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中,是目前實驗室***的轉(zhuǎn)染方法之一,其轉(zhuǎn)染率較高,優(yōu)于磷酸鈣法。

 2、磷酸鈣共沉淀法

 該方法可重復(fù)性差,而且磷酸鈣溶液對溫度、pH和緩沖鹽濃度的變化十分敏感,對細胞尤其是原代細胞毒性較大,也不能采用RPMI培養(yǎng)基,因為其含有高濃度的磷酸鹽。

 3、電穿孔轉(zhuǎn)染法

電流能夠可逆地擊穿細胞膜形成瞬時的小孔促使DNA分子進入胞內(nèi),這種方法就是電穿孔。

 當遇到某些脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率很低或幾乎無法轉(zhuǎn)入時可以用電穿孔法轉(zhuǎn)染。

 一般情況下,高電場強度會殺死50%-70% 的細胞。現(xiàn)在針對細胞死亡開發(fā)出了一種電轉(zhuǎn)保護劑,可以大大的降低細胞的死亡率,同時提高電穿孔轉(zhuǎn)染效率。

 4、病毒感染

 對于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染與電穿孔轉(zhuǎn)染都無法成功轉(zhuǎn)染的細胞系可以采用病毒感染,腺病毒,腺相關(guān)病毒,逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體已廣用于哺乳動物細胞體內(nèi)外的基因轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染效率比較高,適用于較難轉(zhuǎn)染的細胞。

 但是插入的片段長度有一定限制,最重要的是技術(shù)難度比較高,在一般實驗室中很難普及,而且某些病毒起效時間比較慢,跟不上細胞這種快速繁殖的速度,如果只是做簡單細胞系的轉(zhuǎn)染性價比不高。

沒有一種方法適用于所有的細胞和實驗,理想的方法應(yīng)根據(jù)細胞類型和實驗需要進行選擇,如果只是在細胞水平做,而且用的是簡單細胞系,那么脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染是綜合比較起來不錯的一個方法。

 所以,我們主要來探討一下脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染:

 進行實驗之前,請先規(guī)劃好你的實驗,一般細胞轉(zhuǎn)染需要24h-72h,所以要充分了解細胞生長速度,計算所需脂質(zhì)體和DNA的儲備量,并確認有足夠的下列材料:Opti-MEM無血清培養(yǎng)基,Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑,以及DNA,這個一定要確認好,否則生氣都沒辦法怪別人。

 做好以上準備后,具體的操作步驟如下:

 1、細胞鋪板

 (1)一般會選擇復(fù)蘇細胞傳代3-4次(匯合率達到90%之前對細胞進行傳代,不要長到100 %),從解凍過程中恢復(fù)過來可以穩(wěn)定生長的細胞進行細胞轉(zhuǎn)染,傳代次數(shù)高(>30-40)時,細胞的生長速度和形態(tài)會改變。

 (2)如果提總蛋白,一般選擇六孔板進行轉(zhuǎn)染,因為轉(zhuǎn)染的細胞提取蛋白的總量能達到200ug,一般夠做并且需要的DNA和Lipofectamine又相對比較少。

 (3)傳代條件取決于所用的細胞系。對于快速生長的細胞,倍增時間為16小時(如HEK293)。對于生長緩慢的細胞,倍增時間為36小時(如原代細胞)。

 (4)轉(zhuǎn)染當天,將細胞鋪板。如果在轉(zhuǎn)染前一 天或更早時間鋪板,轉(zhuǎn)染效率可能下降,如果是簡單細胞系的轉(zhuǎn)染,可以直接在前一 天晚上鋪板,第二天來轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時,細胞密度會影響轉(zhuǎn)染效率,細胞密度保持在匯合率為70-90%(這個前提是轉(zhuǎn)染24h,如果轉(zhuǎn)染48h則需要匯合率為50-70%),細胞的鋪板和轉(zhuǎn)染也可同時進行。

 2、細胞轉(zhuǎn)染

吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基,用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。更換無血清培養(yǎng)基。準備轉(zhuǎn)染制備液,用滅菌后的EP管制備。

 以六孔板為例,A液:用200μl Opti-MEM稀釋4μg質(zhì)粒;B液:用200μl Opti-MEM稀釋10μl lipo2000,分別將A液、B液輕輕混勻,靜置5min,吸取B液加入至A液中,輕輕混勻,室溫靜置20min。

 加入轉(zhuǎn)染試劑到每個孔的培養(yǎng)基中,6h后,更換成**培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)到24-48小時(不同的質(zhì)粒和脂質(zhì)體**搭配比例不同,轉(zhuǎn)染前,應(yīng)該摸一個**配比。質(zhì)粒:脂質(zhì)體=1:1,1:1.5,1:2,1:2.5,1:3,1:3.5的梯度比例來檢測**轉(zhuǎn)染比例,一般質(zhì)粒有帶熒光,可以通過觀察每組熒光強弱來判斷轉(zhuǎn)染效率)。以下為不同規(guī)格的培養(yǎng)板需要加DNA和lipo2000的量。

123.png

 轉(zhuǎn)染時,應(yīng)使用優(yōu)質(zhì)質(zhì)粒:

 1、通過測量OD 值來確定DNA純度和濃度,測得的OD值應(yīng)介于1.7-1.9之間。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染基于電荷吸引原理,如果DNA不純,如帶少量的鹽離子,蛋白,代謝物污染都會顯zhu影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進行。

 2、含有內(nèi)毒素的質(zhì)粒對細胞有很大的毒性作用。

 轉(zhuǎn)染時,小心輕柔的將lipo2000加到培養(yǎng)基中并輕輕混勻,避免粗暴用力吹打,會導(dǎo)致脂質(zhì)體失效。

 血清一度曾被認為會降低轉(zhuǎn)染效率,老一代的轉(zhuǎn)染方法往往要求轉(zhuǎn)染前后用PBS洗細胞然后在無血清培養(yǎng)基條件下轉(zhuǎn)染,但有些對此敏感的細胞會受到損傷,甚至死亡(比如貼壁較差的細胞,在PBS洗滌時很容易沖刷細胞)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率極低。

 不過轉(zhuǎn)染產(chǎn)品配方幾經(jīng)革新后的當下,對于主流的轉(zhuǎn)染試劑來說,血清的存在已經(jīng)不會影響轉(zhuǎn)染效率,甚至還有助于提高轉(zhuǎn)染效率,但是血清的存在會影響DNA-轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成,在DNA-轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成時需用無血清培養(yǎng)基opti-MEM來稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑,在轉(zhuǎn)染過程中是可以使用血清的。

 轉(zhuǎn)染后6小時更換培養(yǎng)基,因為lipo2000具有一定毒性。

 細胞培養(yǎng)過程中往往會添加抗生素來預(yù)防污染,但是抗生素可能對轉(zhuǎn)染造成困擾。比如青霉素和鏈霉素,青鏈霉素是我們常用來預(yù)防污染的抗生素,就會影響轉(zhuǎn)染,雖然這些抗生素一般情況下對于真核細胞無毒,但當轉(zhuǎn)染試劑增加了細胞的通透性時,就會使抗生素也進入細胞從而間接導(dǎo)致細胞死亡,造成轉(zhuǎn)染效率低。

 目前轉(zhuǎn)染試劑有些已經(jīng)可以全程都用有血清和抗生素的**培養(yǎng)基來操作,非常方便,省去了污染等麻煩。

 3、觀察轉(zhuǎn)染的效果

 在轉(zhuǎn)染后24小時,用熒光顯微鏡觀察實驗結(jié)果并記錄熒光蛋白表達情況,如下圖所示,說明轉(zhuǎn)染成功,且轉(zhuǎn)染效率還可以,如果不帶有熒光,可以用GFP來對照,可以放在一個單獨的孔中,或是與目標質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,同時用Q-PCR和者WB來檢測。

124.png

轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率不高,可以通過兩種方法:

 1、復(fù)轉(zhuǎn)染,即轉(zhuǎn)染后12-24小時再次進行轉(zhuǎn)染,前提是該細胞對脂質(zhì)體的耐受性較好,轉(zhuǎn)染后細胞死亡數(shù)較少。

 2、通過藥篩來殺死未轉(zhuǎn)入成功的細胞。前提是該質(zhì)粒帶有抗生素抗性的基因。


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